UNA PANTALLA DE ACTIVACIÓN DE CRISPR IDENTIFICA UN FACTOR DE HOSPEDAJE INHIBITORIO DEL VIRUS DE LA INFLUENZA PAN AVIAR

En este estudio, utilizaron la tecnología de activación CRISPR / dCas9 para realizar una pantalla de sobreexpresión de todo el genoma para identificar los factores de restricción de IAV. El golpe más importante de nuestra pantalla, B4GALNT2, mostró actividad inhibitoria contra virus de influenza con una preferencia de receptor de ácido siálico. De hecho, la sobreexpresión de B4GALNT2 evitó la infección de todas las cepas del virus de la gripe aviar analizadas, incluidos los subtipos H5, H9 y H7, que previamente han causado enfermedades en humanos. Por lo tanto, hemos utilizado la tecnología de activación CRISPR / dCas9 para identificar un factor que puede eliminar por completo la infección por virus de la influenza aviar.

Se han realizado varios tipos de pantallas para comprender los requisitos de infección viral, replicación o propagación. El trabajo previo sobre IAV se ha centrado casi exclusivamente en la pérdida genética de los estudios de función (es decir, pantallas de ARNi) identificando las proteínas del huésped que son necesarias para permitir la infección por IAV.

Si bien este trabajo ha sido fundamental para identificar los factores que permiten la replicación del virus, ha faltado una pantalla sistemática de sobreexpresión para identificar los factores del huésped que pueden inhibir la replicación del virus. El principal obstáculo para realizar pantallas de sobreexpresión ha sido la tecnología. 

Se ha demostrado que el trabajo reciente que modifica la tecnología CRISPR / Cas9 para reclutar activadores transcripcionales, llamado mediador de activación sinérgica CRISPR (CRISPR SAM), es eficaz para las pantallas de sobreexpresión del genoma completo.

En este trabajo, se ha adaptado la tecnología CRISPR SAM para detectar genes que, cuando se sobreexpresan, inhiben completamente la infección por IAV. Descubriéndose así  genes inhibidores, pero identificamos notablemente una glucosiltransferasa (B4GALNT2) que modificó el ácido siálico que contiene glicanos y previno la infección por cada cepa aviar de IAV probada. Por lo tanto, el uso de la tecnología de activación del gen CRISPR ha permitido la identificación de un gen del hospedador que potencialmente puede ser objetivo para prevenir las infecciones de influenza aviar.

Bibliografìa:

Brook E. Heaton, Edward M. Kennedy, Rebekah E. Dumm, Alfred T. Harding, Matthew T. A CRISPR activation screen identifies a pan-avian influenza virus inhibitory host factor. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5568676/

EJEMPLO DE TERAPIA DE STEM CELLS EN LA INFLUENZA

Las células estromales mesenquimales humanas reducen la lesión pulmonar aguda asociada a la influenza A H5N1 in vitro e in vivo
Actualmente, hay una falta de tratamientos efectivos para la lesión pulmonar aguda como resultado de infecciones respiratorias del virus. En este trabajo, los autores demostraron que las MSC, células madre multipotentes derivadas de la médula ósea, eran eficaces para resolver la patología relacionada con la lesión pulmonar asociada con la infección por la gripe H5N1.

En un modelo de cocultivo in vitro, las células epiteliales alveolares (AEC) se cultivaron con MSC humanas o fibroblastos de pulmón humano de control y se analizaron en cuanto a su capacidad para realizar funciones críticas del epitelio pulmonar. El co-cultivo con MSC condujo a una mejor capacidad para que los AEC transporten fluido desde su lado apical a su lado basal y aumenta la función de barrera de la monocapa de AEC contra el paso de solutos. En ratones viejos infectados con el virus H5N1, el tratamiento con MSCs humanas mejoró las tasas de supervivencia y disminuyó la pérdida de peso corporal como resultado de la infección. En comparación con los animales tratados con fibroblastos, los ratones inyectados con MSC tenían mejores funciones de transporte de fluidos y menos acumulación de proteínas en el líquido de lavado broncoalveolar.

Bibliografía:

Michael C. W. Chan, Denise I. T. Kuok, Connie Y. H. Leung, Kenrie P. Y. Hui, Sophie A. Valkenburg, Eric H. Y. Lau.Human mesenchymal stromal cells reduce influenza A H5N1-associated acute lung injury in vitro and in vivo. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4822574/ 

Link del video: https://www.youtube.com/watch?v=iZ2sYv3N-wY

EJEMPLO DE ADN RECOMBINANTE EN LA NATURALEZA Y EJEMPLO DE AND RECOMBINANTE EN LA INFLUENZA

Ejemplo de ADN Recombinante en la Naturaleza

1. Episomas: en bacterias después de una conjugación, al ceder una cadena monocatenaria de material extracromosómico (plásmido) a una bacteria carente de este, que finalmente termina en la agregación al cromosoma circular del organismo procarionte.

1.  Intercambio de Cromátides hermanas: en la Mitosis cuando las cromátides hermanas (de un único cromosoma) intercambian fragmentos de su material genético. 

Ejemplo de ADN Recombinante en la Influenza

Un ejemplo de ADN recombinante en la Influenza es la producción de "VACUNAS RECOMBINANTES CONTRA LA INFLUENZA". Existe una tecnología de producción de vacunas contra la influenza que fue aprobada para usar en el mercado de los EE. UU.  y que implica el uso de la tecnología recombinante. Este método de producción no requiere virus de la vacuna cultivados en huevos ni usa huevos de gallina en el proceso de producción. En cambio, los fabricantes aíslan una proteína específica de un virus de la vacuna recomendado que crece naturalmente ("tipo salvaje") (la proteína HA, que induce una respuesta inmunitaria en las personas). Estas proteínas luego se combinan con porciones de otro virus que crecen en células de insectos. Este virus "recombinante" de la vacuna luego se mezcla con células de insectos y se deja que se replique. A continuación, la proteína HA de la influenza se cosecha de estas células y se purifica. La proteína purificada se embala mientras se espera que la FDA realice las pruebas y apruebe la distribución de lotes. Por el momento la vacuna recombinante contra la influenza es la única que se produce 100% sin huevos en el mercado estadounidense.

Bibliografía:

Andersen, S; Sekelsky, J. [Internet,2016] «Meiotic versus Mitotic Recombination: Two Different Routes for Double-Strand Break Repair». Disponible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/bies.201000087

CDC. Vacunas contra la influenza. Disponible en: https://espanol.cdc.gov/enes/flu/protect/vaccine/how-fluvaccine-made.htm

EVALUACIÓN COMPARATIVA DE LA EFICACIA DE IAVchip DNA MICROARRAY EN EL DIAGNÓSTICO DE LA GRIPE A

El documento describe la evaluación comparativa de microarrays de ADN IAVchip, PCR de transcripción inversa (RT-PCR) y RT-PCR en tiempo real frente al aislamiento de virus en embriones de pollo y muestra su eficacia diagnóstica en la detección y subtipificación del virus de la influenza A. Las pruebas se evaluaron con el uso de 185 especímenes de humanos, animales y aves. El microarray IAVchip DNA demuestra una mayor eficacia diagnóstica (99,45%) en el diagnóstico temprano de influenza A en comparación con la PCR en tiempo real (98,38%) y RT-PCR (96,22%), lo que demuestra su clara superioridad. La sensibilidad diagnóstica de IAVchip DNA microarray (100%) excede la misma de RT-PCR (95.95%) y RT-PCR en tiempo real (97.96%) en el intervalo de intervalos de confianza estimados.

 El microarreglo de ADN IAVchip y la RT-PCR en tiempo real mostraron la misma especificidad diagnóstica (98.85%), mientras que la especificidad diagnóstica de la RT-PCR fue del 96.40%. IAVchip DNA microarray tiene una ventaja sobre las otras pruebas para el diagnóstico de influenza A y la identificación del virus como un método más rápido que permite realizar la detección y subtipificación simultáneas de alrededor de decenas de especímenes en un experimento durante 8-10 horas. 

Bibliografía:

NCBI [Internet]Comparative Evaluation of Effectiveness of IAVchip DNA Microarray in Influenza A Diagnosis. [Actualizado 23 Nov 2014], disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4274914/

ARTÍCULO DE PCR -INFLUENZA

Tema:  Detección molecular de una nueva influenza humana (H1N1) del potencial pandémico mediante ensayos de RT-PCR cuantitativa convencionales y en tiempo real

Objetivo: Desarrollar un RT- PCR adicional para discriminar de otros virus y subtipos H1 humanos

Muestra Biológica: Aspirado nasofaríngeo

Tipo de Ácido de Nucleico: ARN viral

Genes a amplificar: Gen que codifica para la HA

Extracción del ADN: QIAamp Virus RNA Mini Kit (Qiagen)

Tipo de PCR: PCR en tiempo real

        

     Pasos: 

     Desnaturización: 95 ºC - 30s

     Alinamiento:  57ºC - 30 s

     Extensión: 72ºC - 20s

     Numero de ciclos: 50

Visualización: EFO

Sensibilidad:  1.0 x 104 (a la cuarta) (dosis media infecciosa en cultivo)

Especificidad: 100%

Bibligrafía:

Poon, L; Chan, G; Smith, C; Leung, Y. Molecular Detection of a Novel Human Influenza (H1N1) of Pandemic Potential by Conventional and Real-Time Quantitative RT-PCR Assays. Internet [2013]. Disponible : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19439731

   

PRUEBA DE TAMIZAJE Y CONFIRMATORIA

Prueba de tamizaje para la influenza

Una prueba de tamizaje hace referencia al proceso mediante el cual se permite la detección temprana de factores de riesgo, infección asintomática, o estadios tempranos de una enfermedad clínica, por lo tanto se permite un diagnóstico temprano, tratamiento o una intervención.

Hisopado nasofaríngeo:

Con un hisopo, conteniendo un medio de transporte especifico para virus, el médico o personal entrenado debe frotar el área de la nasofaringe en el período inicial de la enfermedad (primeros 4 ó 5 días; cuando la enfermedad es más contagiosa). La muestra se procesa utilizando un método sensitivo. Un resultado positivo se refiere para confirmación.

Sensibilidad: 50-70%

Especificidad: 90% al 95%

Prueba confirmatoria para la influenza

El análisis de seguimiento también se conoce como prueba confirmatoria. Generalmente se realiza cuando la prueba de detección tiene un resultado positivo. 

La prueba confirmatoria es por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa).

Muestra biologica: Exudado faríngeo

Sensibilidad: 97%

Especificidad: 100%

Bibliografía:

Bonilla, A. Influenza A, laboratorio clínico. Galenus, revista para los médicos.Disponible en: http://www.galenusrevista.com/Influenza-A-H1N1.html

CDC. Información para los médicos sobre las pruebas rápidas de la influenza. Disponible en: https://espanol.cdc.gov/enes/flu/professionals/diagnosis/rapidclin.htm

             

ALTERACIÓN EPIGENÓMICA EN LA INFLUENZA

Se han realizado estudios para determinar si las modificaciones epigeneticas  como los cambios de metilación del ADN( en la célula huésped) están involucrados en la expresión de genes inflamatorios durante la infección por el virus de la gripe. 

Las modificaciones en las regiones reguladoras, particularmente los promotores genéticos están relacionados con los cambios de expresión en los genes. Es por eso,  estudios realizados han intentado  identificar si los cambios en la metilación del ADN del promotor tienen alguna función en la expresión de las citoquinas durante la infección por el virus de la gripe.

Un panel de 24 genes de citocinas y genes que se sabe que están implicados en la respuesta inflamatoria se analizaron para determinar los cambios en la metilación del ADN del promotor durante las infecciones por el virus de la gripe A. Cuatro diferentes cepas de virus de influenza A, a saber. H5N1, H1N1, pandemia (2009) H1N1 y una cepa vacunal de H5N1 se usaron para el estudio.

Y se ha encontrado:7 de los 24 genes inflamatorios estudiados, muestran cambios significativos en los niveles de metilación del promotor en respuesta a la infección por el virus. Estos genes incluyen citoquinas proinflamatorias CXCL14, CCL25, CXCL6 e interleucinas IL13, IL17C, IL4R. 

Se observó hipometilación significativa del promotor en los genes IL17C e IL13 en células infectadas con el virus HPAI-H5N1 en comparación con otros virus de influenza.  Esta hipometilación, lleva a un aumento de la expresión de los genes inflamatorios, y esto aumenta significativamente la patogenicidad del virus. 

Bibliografía:

Mukherjee,S; Veena C. Vipat;  Alok K. Chakrabart. Infection with influenza A viruses causes changes in promoter DNA methylation of inflammatory genes [Internet] 2013. [Citado 19 Abril del 2018]. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4634256/

Link del video: https://www.youtube.com/watch?v=_USmPRDfYq0&feature=youtu.be